تبدأ مواسم Knockout Town الأربعة في 7 ديسمبر: رحلة الأجسام الطائرة المجهولة، والمشاجرة حول موقع ويب تجميد الكائنات الفضائية المتحمس موقع PlayStation

في المقابل، قد يكون تاريخ C57BL/6 ممتازًا شائعًا، نظرًا لكونه من أكثر مرشحات البحث غير المستخدمة، ولأن أكثر من 1000000 جينوم مُصنّع بتقنية CRISPR تستخدم C57BL/6 كجينوم مرجعي. يوفر اتحاد تسلسل جينوم الفأر (MGSC) إرشاداتٍ دقيقةً لتسلسل الجينوم لإنتاج الحمض النووي للمتبرع. يجب اختبار موقع كل إدخال مُستهدف بدقةٍ لضمان عدم تقييد العناصر التنظيمية. حتى مع استخدام تقنية CRISPR، يصعب إنتاج إدخالاتٍ أعلى من 5 كيلو بايت في الفئران.

على سبيل المثال، لتوليد أليل ناقض مشروط، يعمل حمض نووي SS متبرع به إكسون/إكسونات مفلطحة مرة واحدة بكفاءة أعلى من مجرد استخدام زوج من sgRNAs لإدخال مواقع loxP في وقت واحد. على الرغم من عدم تطابقها مع المتطلبات الفعلية في زيجوت الفأر، إلا أنه سيتم التحقق من صحة sgRNAs في مجتمع العضلات إذا لم تكن الفئران المانحة لتحليل الكيسة الأريمية للفئران متاحة بسهولة (ران وآخرون، 2013أ). يمكن استخدام أنسجة جذعية، مثل وانغ وآخرون، 2013؛ يانغ وآخرون، 2013) لتحديد أداء تعديل الجينوم قبل الحقن، مثل أن الخلايا الجذعية تتمتع بكفاءة HDR أفضل من العضلات الجسدية (يو وآخرون، 2015).

اعتبارات التاريخ

بالإضافة إلى أداء sgRNA، هناك قلق آخر بشأن تعديل الجينوم يتمثل في احتمالية حدوث طفرات بعيدة عن العنوان، خاصةً عند محاولة التعرف على نمط ظاهري جيد للفأر. توفر معظم برامج تصميم CRIPSR sgRNA ملخصًا لمواقع عنوان المصدر المحتملة، لذلك، كلما أمكن، يمكن استخدام طريقة جيدة تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد طفرات indel في هذه المواقع باستخدام اختبار عدم التطابق الكيميائي. سيتم توفير التكاثر لفأر بري "نظيف" للمساعدة في عزل الطفرات غير المرغوب فيها (سيتم إجراء تهجينين على الأقل لتقليل الطفرات غير المستهدفة) (Raveux et al., 2017).

2 تثبيت وتوليد الركيزة الخطية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل

سيكون تعديل معاييرنا للإباضة الفائقة وجمع الزيجوت ضروريًا، ولكن ليس ضروريًا، عند استخدام ضغوط إضافية (Qin et al., 2016). يمكن أحيانًا إنتاج sgRNA الخاص بك وmRNA Cas9 الخاص بك إلى الزيجوت الفأري بفضل المعالجة السيتوبلازمية، والتي تميل إلى التلاعب بمعالج دقيق يعتمد على البيزو، أو من الحقن النووية الأولية، عادةً باستخدام محقن دقيق ممتاز (Yang et al., 2014). بشكل عام، لم تُلاحظ أي اختلافات ظاهرية في كلا نوعي التوصيل (Horii et al., 2014).

لإجراء تعديل الجينوم american express طرق الدفع عبر الإنترنت في أنسجة الثدييات، من المرجح أن تُزيل هذه الحذفات جينًا سليمًا نتيجةً لطفرةٍ في تغيير الهيكل. وإذا أمكن الحصول على الحمض النووي للمتبرع، فقد يُعالج أحدث DSB باستخدام HDR، حتى وإن كان ذلك بمعدلٍ أقل من NHEJ. وقد تم تكييف CRISPR-Cas9 لاحقًا للتلاعب الوراثي في الكلاب فقط، على سبيل المثال، لإنتاج حذفٍ وحذفٍ للجين في الفئران.

يمكن أيضًا استخدام إعادة التركيب لإجراء عمليات الحذف، والطفرات الجزئية، والتضاعف، والانعكاسات، والاندماجات، والعلامات. ركيزة DNA خطية ممتازة تحتوي على التغيير المطلوب، وإلا يتم نقل التماثلات إلى الحمض النووي الموجه إلى النسيج. Gam ليس ضروريًا لإعادة التركيب، ولكنه يزيد من حجم إعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) بنحو 20-فليكس. Exo هو نوكلياز خارجي ثنائي السلسلة (5'→3') ضروري لإعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة. بروتين بيتا الجديد، وهو بروتينات تلدين الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، هو إعادة التركيب الرئيسية في إعادة التركيب. والجدير بالذكر أن خدمات إعادة التركيب المضيفة، مثل بروتين إعادة التركيب الدقيق RecA، ضرورية عادةً لإعادة التركيب.

وفقًا لخطة موقع loxP الإلكتروني، يُنتج عن إعادة التركيب الجيني الجديدة إزالة أو انعكاسات لجينات العنوان. نظرًا للخصائص القابلة للتحريض لجين cre-loxP، يُسبب خروج الجين الجديد مواد كيميائية، مثل التتراسيكلين والتاموكسيفان. يُحفز تكوين التتراسيكلين داخل الجين نسخ إنزيم cre recombinase الجديد، بينما يتولى التاموكسيفان مسؤولية النقل النووي. تُنشئ البادئات الجانبية شيئًا ما في المكان الذي يقع فيه الحذف غير المتماثل في وحدة تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد. ثم يُشق أي عدم تطابق بواسطة إنزيم T7E1 (WT – النوع البري؛ HT – متغاير الزيجوت) لإنتاج بضع شظايا أصغر في محلول الأجاروز.

بينما يُغيّر آل أوليفاريس وضعية جذعهم لدخول المعركة الداخلية الجديدة على يمين كاستيلو، ستُشكّل لكمة كاستيلو اليمنى العلوية إطارًا لمنع أوليفاريس من الحصول على ضربة خطافية. بالنسبة لنوع الجسم في الوضعية المناسبة، يُوجّه كاستيلو لكمة علوية لإفساح المجال له ليتمكن من الخروج من المعركة الداخلية، مُعيدًا ضبطها إلى طول مُناسب. مع ذلك، عندما لم يكن أوليفاريس قادرًا على دخول المعركة الداخلية على جانبهم الأمامي المُعتاد، انخفضت قدرته على المُراوغة بضرباتهم الخطافية المتبقية بشكل ملحوظ.

إلى جانب الحذف المرتفع، أظهرت أعلى معدلات إدخال جينومي إمكانية الاستفادة من تقنية كريسبر (تشانغ وآخرون، 2015). كما وُصفت حقنة من جزيئتي sgRNA توأمين كوسيلة لزيادة احتمالية استهداف الجينات الجديدة، خاصةً عند الحاجة إلى تعديل الجينات ثنائية الأليلات (تشو وآخرون، 2014). وُجدت طفرات خارج العنوان بشكل رئيسي لتعديل جينوم كريسبر في خلايا الأورام الخبيثة البشرية، ولكنها قد تصبح غير طبيعية في زيجوت الفأر (فو وآخرون، 2013؛ يانغ وآخرون، 2013). ومع ذلك، تظل الطفرات خارج العنوان مصدر قلق عند دراسة الفئران المعدلة وراثيًا. يؤدي قطع واحد لجين Cas9n إلى كسر في خيط واحد فقط، والذي يُصلح بسهولة؛ لذلك، لإنشاء DSB حقيقي، من المتوقع وجود جزيئتي sgRNA. لقد غيرت تقنية CRISPR-Cas9 بشكل كبير الجينات التي تركز داخل أنسجة الفئران منذ أن كانت وسيلة لتعديل الجينوم في الفئران، على سبيل المثال بالنظر إلى التصميم البسيط والخروج السريع اللازم لاستخلاص الفئران المؤسسة.

• لأن منطقة دوران الحضرية رأسه على الجانب الشرفي العلوي من بالومينو، بالومينو غير قادر على وضع الخطاف الأيمن في المقدمة.
• يفتقر موقع EcoRI الإلكتروني الحريص على تثبيت الحمض النووي للمتبرع الخاص بك حتى تتمكن من استيعاب النمط الجيني للفأر المولد بتقنية CRISPR الخاص بك حيث لا يتم قطع حلقة KI PCR من Re.
• قد تحتاج عمليات الإدراج أو الحذف الأعلى، ولكن ليس أكثر، إلى عدد قليل من sgRNA لإكمال مدة الحمض النووي الجينومي الذي من المحتمل استبداله أو إزالته.
• تُفضل عادات الفئران الشرطية لدراسة المشكلات الفردية لأن كل منها يشير إلى التشابه داخل النمط الظاهري عندما تتم إزالة جينات عائلية محددة.
• تم إجراء إدخالات بحجم 1-2 كيلوبايت باستخدام CRISPR، ومع ذلك فإن كفاءة HDR تنخفض بشكل أساسي لأن أبعاد حجم الإدخال الأحدث تنمو إلى ما هو أبعد من ذلك الحجم.

خارج نطاق نوكلياز الحمض النووي لـ Cas9، أُعيد استخدام CRISPR ليشمل بيئةً تعتمد على الحمض النووي الريبي للتحكم في النشاط النسخي الجديد للجينات العائلية المُستهدفة. يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام Cas9 مُعطّل (dCas9) مرتبط بمنشطات النسخ، ومثبطات النسخ، ومعدلات التخلق الجيني (Komor et al. 2017). كبديل، يتم تنشيط الجينات المستهدفة التي تحتوي على Cas9 من النوع غير النشط باستخدام sgRNAs ميتة مُعدّلة مُكوّنة من أبتامرات MS2 ذات الدبابيس الشعرية. تُختصر هذه sgRNAs الميتة لتجنب إنتاج DSB، لأن أبتامرات MS2 توظف بروتينًا أساسيًا مُركّبًا يتكون من بروتينات طبقة البكتيريا MS2 الجديدة المرتبطة بمنشط النسخ (Liao et al. 2017). لقد ثبت أن استراتيجية تنشيط الجينات المستهدفة موجودة داخل الفئران، وبالتالي يمكن التركيز على الجينات المعروفة بقدرتها على تحسين العدوى، بما في ذلك جميع أشكال مرض السكري، وأمراض الكلى، وربما ضمور العضلات.

استغرقت هذه الجينات التي تركز على التقنيات، بالإضافة إلى التطوير النهائي لتقنية CRISPR-Cas9، وقتًا أقل بما يكفي لتطوير فئران مصممة طبيعيًا من 8 إلى 10 أيام إلى 3 أشهر. مع ذلك، فقد حلت تقنية CRISPR-Cas9 محل ZFNs وTALENs في التصميم والهيكل البسيط (الشكل 1). تعتمد ZFNs وTALENs على نظام أسماء نطاقات ربط الحمض النووي متعدد الوحدات لكل عنوان جينومي جديد. تستخدم تقنية CRISPR تخليق معقد ريبونوكليوبروتين جيد بين نوكلياز الحمض النووي Cas9 وRNA "الدليلي" الذي ينتج عنه تسلسل ثنائي الترابط الجينومي في 20 زوجًا قاعديًا من التسلسل التكميلي المطابق.