YLEX酵母表達試劑盒

YLEX酵母表達試劑盒
描述
基於INRA INAPG許可專利*的YLEX Expression Kit提供了一種簡單的方法，用於克隆和表達酵母，解脂耶氏酵母中感興趣的基因。使用該試劑盒，通過選擇提供的表達載體pYLEX1或pYLSC1，可以在細胞內表達高水平的異源蛋白質或從細胞分泌到培養基中。

YLEX中提供的載體含有強雜合啟動子，其攜帶來自pXPR2的四個串聯拷貝的上游激活子序列（UAS1B）片段和最小的pLEU2片段。與常用的耶氏酵母屬啟動子（pXPR2）不同，這種穩定的雜合啟動子不斷地指導蛋白質表達，而不受培養基中營養和環境因素的多重影響。

當具有雜合啟動子的隨後被克隆的目的基因構建的質粒被選擇的限制酶線性化時，它變成可以通過轉化過程中的同源重組整合到解脂耶氏酵母基因組中的表達盒。取決於分泌信號是否出現在質粒上，成功的轉化體準備好表達或分泌重組蛋白。有關詳細信息，請閱讀本目錄中引用的文章。

* INRA（國家農業研究所）和INAPG（Institut National Agronomique Paris-Grignon）

特徵
    • 安全：
      Y. lipolytica被美國FDA（食品和藥品管理局）歸類為GRAS（通常認為是安全的）
    • 簡單：
     表達異源蛋白質的簡單工具
    • 容易操作：
     像大腸桿菌和釀酒酵母一樣
    • 穩定：
     載體和構建的質粒具有很強的穩定性
    • 可靠：
     整合在基因組中相同位點的載體
    • 靈活：
     提供表達和分泌載體（蛋白質可以在細胞內表達或從細胞分泌到培養基中）
    • 高增長能力：
     分泌能力高，產量高
    • 減少蛋白質降解：
     沒有由特殊蛋白酶缺陷型耶氏酵母菌株合成的細胞外蛋白酶
    • 大量生產：
     重組蛋白的工業大規模生產
    • 較少的高糖基化：
     與釀酒酵母不同，它能夠進行複雜蛋白質的翻譯後加工

步驟

應用
細胞內或細胞外的異源蛋白質表達取決於GRAS酵母中的選定載體。
耶氏酵母載體
該試劑盒中包括兩種載體（pYLEX1和pYLSC1），它們可用於解脂耶氏酵母中感興趣的蛋白質的細胞內表達或分泌。一般而言，如果標靶蛋白是胞質和非糖基化的，則pYLEX1載體是更好的選擇。如果您感興趣的蛋白質通常是糖基化或分泌的，您可能希望選擇pYLSC1載體。

pYLEX1表達載體（7259bp）含有強雜合啟動子（hp4d），其攜帶來自pXPR2的四個串聯拷貝的上游激活子序列（UAS1B）片段和最小的pLEU2片段。多克隆位點和XPR2轉錄終止子緊鄰hp4d啟動子的3’位點的下游，然後是亮氨酸選擇標記基因（LEU2）。通過用NotI消化可以使載體線性化，以產生能夠插入解脂耶氏酵母基因組的線性DNA片段。

pYLSC1分泌載體（7205bp）含有雜合啟動子（hp4d）和分泌信號（XPR2前區）。多克隆位點和pXPR2轉錄終止子緊鄰XPR2前區的3’位點的下游，接著是亮氨酸選擇標記基因（LEU2）。通過用NotI消化可以使載體線性化，以產生能夠插入解脂耶氏酵母基因組的線性DNA片段。
酵母菌株
解脂耶氏酵母的菌株Po1g是野生型菌株W29（ATCC 20460）的衍生物，通過一系列遺傳修飾。簡言之，用來自釀酒酵母的SUC2基因破壞W29菌株中的原始URA3基因，然後在LEU2基因中引入缺失。此外，XPR2和AXP基因的缺失確保Po1g不能產生任何細胞外蛋白酶。為了容易地整合基於pBR的表達/分泌載體，將pBR322對接平台整合到URA3基因座。

Strain	Genotype	Phenotype
Po 1 g	MatA, leu2-270, ura3-302::URA3, xpr2-332, axp-2	Leu-, ΔAEP, ΔAXP, Suc+, pBR platform

質量控制
使用兩種質粒pYLEX1 + AMY1（小鼠唾液α-澱粉酶基因）和pYLSC1 +AMY1Δ（沒有其天然分泌信號的AMY1）來確保功能性轉型試劑盒和宿主中正確的基因表達。還進行污染測試以確保沒有其他微生物污染。
實驗數據
該圖顯示來自編碼澱粉酶的轉化體（YL＃2和＃3）的分批培養的過濾培養基可以在固體培養基瓊脂中消化澱粉，並隨後產生透明區域。相反，來自僅用載體轉化的酵母培養基（YL＃1）的培養基沒有表現出相同的結果。這表明通過使用YLEX表達試劑盒成功地將α-澱粉酶基因（AMY1）克隆到pYLEX1和α-澱粉酶基因而沒有其分泌信號肽（AMY1D）到pYLSC1中。在兩種情況下，活性α-澱粉酶有效地分泌到培養基中。

YLEX系統（解脂耶氏酵母表達系統）中高細胞密度發酵和重組酶分泌能力的時程研究。

異源蛋白質的過量產生（SDS-PAGE分析）：上清液中重組酶的分泌譜，通過時間過程收集樣品，10μL/泳道。

高細胞密度發酵：在14L補料分批發酵罐中進行高細胞密度發酵，通過時間過程離心（3,000rpm）細胞。

* YLEX Expression Kit（產品規格）
解脂耶氏酵母菌株：Po1g; pYLEX1-表達載體1刺; pYLSC1-分泌載體5μg;引物6560F（用於測序目的）250μL;引物6904F（用於測序目的）250μL; YLOS轉化試劑盒1試劑盒（120 rxns）。

* YLEX Expression Kit由Yeastern Biotech Co.，Ltd。生產，專利保護，由法國國家農業研究所（INRA）的專有財產授權，在全球範圍內進行非獨家製造和分銷。

規範
存放在

Manual